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吉玛新闻
  • RT-PCR指南
  • 作为一种新型的PCR技术,Real-Time PCR技术将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起,与通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时观测PCR反应进行的情况,解决了传统PCR难以对扩增起始模板的量进行测定的难题,并具有快速、避免交叉污染等特点,在基因检测、基因表达、SNP分析等领域得到广泛的应用。

     

    定量PCR对起始模板定量

     
     

    应用定量PCR进行基因表达研究

    快速、高效、高通量是应用定量PCR进行基因表达研究的特点,可在2个半小时内同时完成对多个基因的表达研究。

     
     

    绝对定量和相对定量

    研究者在实验中如果想要得到目的基因的绝对量,则应采用绝对定量的方法;如果只是需要知道目的基因相对与某一基因(通常是管家基因)的表达情况,则可采用相对定量的方法。
    绝对定量最为简单的方法就是标准曲线法,用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线,得到目的基因的Ct值后再利用标准曲线换算出目的基因的绝对量。标准品可以是纯化的质粒dsDNA,体外转录的RNA,或者是体外合成的ssDNA。
    绝对定量有外标和内标两种定量方法。外标法指的是标准品和目的基因在不同反应管内扩增,这种定量方法的一个前提条件是标准品和目的基因的扩增效率是一致的,然而事实上,在绝大多数的实验中,要想使标准品和目的基因的扩增效率完全一致是不可能的;外参照的标准品无法检测也不可能补偿可能出现在目的基因反应体系中的影响因素,如PCR抑制子等。此外,外标法还常受标准品制作、标准品稳定性及实验操作等因素的影响。
    为反映体系中可能出现的PCR影响因素,可引入一个内标同目的基因在同一反应体系中同时进行扩增。内标法又可分竞争性内标和非竞争性内标。竞争性内标具有与目的基因序列相同的引物结合位点,但不具有相同的探针结合位点;非竞争性内标则既不和目的基因共用引物也不共用探针。相对比较常用的是竞争性内标法。由于竞争性PCR能够消除反应体系中干扰因素的影响,所以它所等到的结果要准确可靠得多,但是由于在反应体系中同时扩增两种模板,使得其结果的测定范围比单使用外参要大为缩小,往往只有2-3个数量级,此外内标法还应考虑的因素是竞争性抑制效应。实验者可根据实验的具体情况选择是采用外标定量还是内标定量的方法。

     

    相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线,根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量,再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果。目前更为常用的方法是2-△△Ct 方法,在该公式中,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-( Ct目的基因- Ct管家基因)对照。2-△△Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的量,而不必制作标准曲线,所以更为简便省时。但此方法要求目的基因和管家基因的扩增效率一致,然而实际情况往往并非如此。
    为此,可在2-△△Ct 方法的基础上引入效率评价即(1+E)-△△Ct 方法,其中E为扩增效率。计算扩增效率可以采用标准曲线斜率换算法,此方法为梯度稀释目的基因扩增片断及管家基因扩增片断,PCR后分别建立两条标准曲线并根据斜率计算扩增效率,计算公式为E=10-1/slope
    。另一种计算扩增效率的方法为观察PCR刚进入指数扩增期阶段的荧光强度变化,计算公式为Yn=Yo×En 。有的定量PCR仪的操作软件具有自动计算扩增效率的功能,无需实验工作者另行计算PCR扩增效率。

     
     
     


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