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吉玛新闻
  • RNAi指南
  • RNAi技术发展的历程

    1998:植物基因中基因沉默现象的发现
    2000:哺乳动物细胞中基因沉默的实现
    2001:被《科学》评为当年十大科技突破之一
    2003:动物体内观察到RNA干扰作用
    2004:在恒河猴上的SARS病毒研究取得进展
    2004:Acuity Pharmaceutical 第一个RNA干扰药物申请IND
    2004:siRNA Therapeutics 第一个RNA干扰药物申请IND
    2005:第一个RNA干扰药物进入一期临床,取得良好的效果
    2005:化学修饰的siRNA oligo 体内系统给药取得突破
    2006:Andrew Z. Fire和Craig C. Mello因在RNA干扰领域的成就获得诺贝尔医学/生理学奖

     

    RNAi实验原理

    RNA干扰(RNA interfering,RNAi)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的,dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA),随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

     

    上海吉玛公司以国际上最先进的设计理念为依托,综合我们对RNAi文库筛选以及从客户反馈的结果,上海吉玛公司优先考虑的设计原则有以下几个方面:

    1. siRNA 设计原则

    1.siRNA双链末端的热稳定性,即的值

    2.siRNA双链的反义链末端最后两个碱基的选择,即:20,21位置碱基的选择

    3.siRNA双链的反义链第1和第19位置的碱基的选择

    4.siRNA反义链的G+C的含量

    5.siRNA反义链的第2位和第18位置的碱基的选择

    6.siRNA反义链的第2位到17位局部稳定性的选择

    7.siRNA双链的正义链为基准,整个双链稳定性的分布为,5’末端稳定性强,双链中间段,以断裂位点周围为例,稳定性较弱,3’段稳定性较弱

    Sense:

    5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNN TT

    3’

    antisense:

    3’ NN NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

    3’

    mRNA:

    5’ dNdN NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

    3’

    注:正义链sense: 19碱基的靶点+TT悬头

    反义链antisense:21个碱基完全与靶点互补

    反义链最后两个碱基为脱氧核酸dNdN

    2.shRNA设计原则

    shRNA设计原则与siRNA设计原则相比有其特殊性。源于shRNA的siRNA相对于外源导入的siRNA在细胞内的有效浓度要低。shRNA末端设计以及双链的热稳定性是以DNA设计为基础,而siRNA是以mRNA为基础。

    1. 从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始,寻找“AA或者NA”二连序列,并记下其3'端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。
    2. 避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。
    3. siRNA序列的GC含量应为30%-60%左右。
    4. 在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区(untranslated regions,UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
    5. 将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。
    6. 将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。由于没有完整的虾的基因组序列,比对起来相对困难。
    7. 选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到最有效的siRNA序列。
    8. 阴性对照:一个完整的siRNA实验应该有阴性对照,作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱,同样需要检查它和其他基因是否具有同源性。
    9.有结果显示,UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别,因为这个突出端无需和靶序列互补。合成siRNA时可直接提供以AA打头的21个碱基序列。


    研究基因功能的新工具

     

    由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰,可以特异地将特定的基因沉默,从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低,因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。目前已经进入应用RNAi研究基因功能的告诉发展的时期,抓住这个强力有力的工具,抓住机遇,加速基因功能的研究。

     

    基因治疗

    随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学技术的出现,广义上把凡是通过改变人体内的基因表达以达到治疗疾病的方法均可称为基因治疗(gene therapy)。用RNAi特异性地抑制如艾滋病病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这类基因保持在静默或休眠状态,从而有望用这种新的手段治疗各种病毒性疾病和恶性肿瘤等疑难病症。

     

    药物开发

    RNAi技术可以作为寻找新的药物靶标的工具,可以快速、大规模、高通量的对发现的药物靶基因进行功能分析。同时,siRNA基因药物具有高度的序列特异性和非常小的毒副作用。利用这个技术可以用于确定人类细胞中的疾病途径,为小分子药物筛选靶物质,以及建立新的生物制药方法和诊断学方法。再者,它还能帮助鉴定药物作用的生化模式,以及其他与此作用相关的基因。RNAi技术已被作为高通量药物靶标识别和确认的工具之一。

     

    吉玛公司为客户提供RNA干扰技术品种齐全的产品

     

    RNAi方法的选择

     
     

    化学合成法的优越性

    GenePharma公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。l 最省时—四天内到货l 最省事—设计都可以委托GenePharma公司免费完成, 收到siRNA oligo后直接与转染试剂混合就可开始实验l 最省钱—500元/对, 三对里就应该有一对抑制效率在70%以上

     

    化学修饰stableTM siRNA oligo

    RNAi技术的最大难题就是化学合成siRNA稳定性问题。GenePharma化学修饰stableTM siRNA最大的目标就是一次性获得最佳的实验数据。我们的方法就是使用RNAi-Mate转染试剂将化学修饰stableTM siRNA导入哺乳动物细胞中,获得如下满意结果:

    1. 高效的基因沉默
    2. 高稳定性—在血清和培养基中
    3. 最大限度减少副作用

    更长的作用时间

     

    化学修饰stableTM siRNA oligo与普通的siRNA oligo性能对照表

     

    关键难题

    标准的siRNA

    化学修饰stableTM siRNA

    siRNA 降解

    标准的非修饰的siRNA在细胞培养过程中很容易降解虽然在大部分的离体实验中是有效的,但是在细胞培养中寿命较短。

    GenePharma化学修饰stableTM siRNA不仅增强了在血清和细胞培养中的寿命,而且加强了在离体条件下的应用能力。

    作用时效

    作用时间较短,一般情况下为一周左右。

    GenePharma化学修饰stableTM siRNA作用时间长,比标准的siRNA的作用时间延长一倍左右

    活体应用的活性

    标准的siRNA稳定性较差,一般不适用于体内试验

    GenePharma化学修饰stableTM siRNA在体内的稳定性强。

     

    shRNA表达载体法

    多数的shRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人源的H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol III 启动子下游。GenePharma公司的shRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究,载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。

     

    siRNA 套餐服务

    客户只需提供基因序列GeneID或者Accession number, 我们免费帮您设计选择合适的位点,保证至少有一对可以有效的抑制相应基因的表达,抑制效率可达70%以上,如果没有筛选出有效的siRNA 片段,吉玛公司为您免费再次设计与合成。

     

    shRNA套餐服务

    shRNA表达载体带有抗生素标记,可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。对于一个已知有效的 siRNA序列(例如,经过siRNA合成方法筛选获得的),需要维持较长时间的基因沉默时,推荐使用shRNA载体系统。GenePharma公司致力于提供最先进和最方便的shRNA相关工具,最近推出新一代shRNA表达质粒,一种高效即用型载体,该载体在细胞内可以持续产生shRNAs,从而达到持久抑制目标基因表达的目的。针对目的基因设计并制备4个shRNA载体,确保4个shRNA中至少一个在mRNA水平的基因的抑制效率在70%以上.

     

    RNAi经典参考文献

    1.Cogoni C, and Macino G. (2000) Post-transcriptional gene silencing across kingdoms. Genes Dev 10: 638-643.
    2.Guru T. (2000). A silence that speaks volumes. Nature 404, 804-808.
    3.Hammond SM, Caudy AA, Hannon GJ. (2001) Post-transcriptional Gene Silencing by Double-stranded RNA. Nature Rev Gen 2: 110-119.
    4.Guo S, and Kempheus KJ. (1995). Par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell 81: 611-620.
    5.Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, and Mello CC. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.
    6.Timmons, L., and Fire, A. (1998) Specific interference by ingested dsRNA. Nature 395: 854.
    7.Timmons L, Court D, and Fire A. (2001) Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene 263:103-112.
    8.Tabara H, Grishok A, and Mello CC. (1998) RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science 282: 430-431.
    9.Grishok A, Tabar H, and Mello CC. (2000) Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science 287: 2494-2497.
    10.Sharp PA, and Zamore PD. (2000) RNA Interference. Science 287: 2431-2433.
    11.Sharp PA. RNA Interference-2001. (2001) Genes Dev 15: 485-490.
    12.Kennerdell JR, and Carthew RW. (1998) Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell 95: 1017-1026.
    13.Kennerdell JR, and Carthew RW. (2000) Heritable gene silencing in Drosophila using double-stranded RNA. Nature Biotech 18: 896-898.
    14.Hamilton AJ, Baulcombe DC. (1999) A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286: 950-952.

     


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